Ausgrabungen » puma basket platform patent

ÿþVor dem Hintergrund einer früheren Studie [25], in der puma basket platform patent gezeigt wurde, dass ErbB4 mit Bcl-2 interagiert und dass EGFR / EGFRvIII und ErbB4 eine strukturelle Homologie aufweisen, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII mit den drei proapoptotischen Proteinen, die mit Bcl-2 koexprimieren, einen Komplex bildet Rezeptoren. Wie aus den Ergebnissen der Immunpräzipitation (IP) / Western-Blotting unter Verwendung eines EGFR-Antikörpers für IP (1c) hervorgeht, bildet EGFRvIII in GBM-Xenotransplantaten mit endogenem EGFRvIII (D-270 MG) einen Komplex mit PUMA, jedoch nicht mit Bax und Bmf und D-317 MG) und mit stabil transfiziertem EGFRvIII (U87MGEGFRvIII). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PUMA in drei EGFR-exprimierenden GBM-Zelllinien mit EGFR coimmunopräzipitiert (1d).

Die Regressionsanalyse zeigte, dass die Expression von EGFR signifikant und positiv mit PUMA korreliert (p = 0,039, R = 0,9) und dass EGFR allein, PUMA allein und ihre Co-Expression signifikant und positiv mit dem Gliomgrad korrelierten (* EGFR / PUMA, p = 0,018) , puma basket platform white R = 0,94; ** EGFR, p = 0,00005, R = 1,0; PUMA, p = 0,021, R = 0,93). (B) Repräsentative immungefärbte primäre Gliome. Oberes Feld: Ein primäres GBM, das sowohl für EGFR / EGFRvIII als auch für PUMA positiv gefärbt ist. Bodenplatte: Ein Grad II-Gliom, das für beide Proteine  puma basket rosa  eine negative Färbung zeigt. In diesen Studien wurden aufeinanderfolgende Tumorschnitte verwendet.

Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen puma basket sale Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

Nach der Behandlung mit Anisomycin gab es nur 3,1% Apoptose in U87MG-EGFRvIII-Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten die isogenen U87MG-Vektorzellen mit niedrigem EGFR-Gehalt eine massive Apoptose (49,8%), ähnlich wie bei der PUMA-Herunterregulierung (45,5%). Die Ergebnisse in 3 zeigen zusammengenommen, dass die GBM-Apoptose durch PUMA positiv reguliert und durch EGFR / EGFRvIII negativ beeinflusst wird, was darauf hindeutet, dass die PUMA- und EGFR / EGFRvIII-Pfade funktionell aber umgekehrt mit der Apoptose in GBM-Zellen verbunden sind. 4 zeigen, dass in GBM-Zellen EGFR / EGFRvIII und PUMA unter nicht belasteten Bedingungen einen Komplex bilden und dass der Komplex auch nach der Behandlung mit dem Apoptose-Induktor Staurosporin (ST) erhalten bleibt.

U87MG-EGFR- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektanten und T98G-GBM-Zellen mit endogenem EGFR wurden mit 1% DMSO und 1 & mgr; M Apoptose-induzierendem Staurosporin (ST) behandelt, geerntet und einer Immunpräzipitation / Western Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechts) unterzogen panel), wie bereits beschrieben. Es ist bekannt, dass sich PUMA auf den Mitochondrienmembranen befindet, um bei entsprechendem Stress eine Apoptose auszulösen [40; 41]. Begründet durch unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA gemeinsam exprimieren und interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR puma basket satin / EGFRvIII die subzelluläre PUMA-Lokalisierung regulieren könnte.

PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma dieser Zellen unter unbelasteten und gestressten Bedingungen lokalisiert, was durch die niedrigen mtPUMA-Indizes angezeigt wird. Ähnliche Beobachtungen wurden auch in T98G-GBM-Zellen gefunden, die auf natürliche Weise EGFR exprimieren (5c). Der bescheidene Nachweis von mitochondrialem PUMA in diesen Zellen kann möglicherweise das Ergebnis einer unzureichenden zytoplasmatischen EGFR sein, um mit allen PUMA-Molekülen im Zytoplasma zu interagieren und diese zu sequestrieren. Wichtig ist, dass der siRNA-vermittelte Abbau der EGFR-Expression zu einem signifikanten Anstieg (16-fach) des mitochondrialen PUMA führte (Abb. 5c-links), was weiter darauf hindeutet, dass EGFR die mitochondriale PUMA-Translokalisierung modulieren kann.